PEMERIKSAAN WIDAL

I.       Tujuan:

Untuk mendeteksi antibodi terhadap Salmonella typhi, Salmonella paratyphi  A, B, dan C.

II.    Prinsip:

Terjadi reaksi aglutinasi antara antigen Salmonella dan antibodi spesifik yang terdapat dalam serum penderita demam tifoid atau paratifoid.

III. Bahan Pemeriksaan

Diperlukan sepasang serum masing-masing 1 ml, yaitu serum pada fase akut dan konvalesen dari penderita tersangkut tifoid. Serum konvalesen diperoleh pada hari ke 5-7 setelah pangambilan darah fase akut.

IV.  Alat dan Reagen yang digunakan:

Alat:

§  Tabung reaksi dari gelas (pyrex atau yang sejenisnya) dengan garis tengah luar12 mm, panjang tabung 75 mm.

§  Rak tabung (logam)

§  Penangas air dengan suhu 56⁰C

§  Pipet serologi 5 ml dan mikropipet ”adjustable” 100 ul.

§  Botol bekas obat suntik dengan volume 10-15 ml.

Bahan:

§  Suspensi antigen O dan H dari Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B dan C.

V.    Prosedur pemeriksaan

a.       Cara tabung

1.      Untuk pemeriksaan 1 sampel diperlukan 24 tabung reaksi yang disusun sebagai berikut:

 

2.      Lakukan pengenceran serum dalam 3 botol kecil seperti dibawah ini, sehingga diperoleh pengenceran 25, 50 dan 100 kali.

 

                                                                   5 ml                  5 ml

Serum 0,4 ml

Larutan garam fisiologis               9,6 ml              5 ml                 5 ml            

Pengenceran                                  25 X                 50 X                100 X

3.      Tabung baris I diisi dengan serum yang telah diencerkan 25 kali, masing-masing sebanyak 0,5 ml. Begitu pula dengan tabung baris II dan III diisi dengan serum yang telah diencerkan 50 kali dan 100 kali.

4.      Isi lajur 1, 2, 3 dan 4 masing-masing 0,5 ml antigen H dari S. typhi (H), S. Paratypi A (AH), B (BH) dan C (CH). Begitu pula dengan tabung pada lajur 5, 6, 7 dan masing-masing diisi dengan antigen O dari S. typhi (O), S. paratyphi A (AO), B (BO) dan C (CO).

Setelah penambahan antigen, pengenceran serum dalam baris I, II dan III menjadi 50, 100 dan 200 kali.

5.      Inkubasi tabung-tabung tersebut dalam penangas air pada suhu 56⁰C selama 24 jam, kemudian diangkat dan disimpan pada suhu kamar selama 20-24 jam.

6.      Perhatikan aglutinasi yang terbentuk awan halus (pada antigen H) dan berbentuk partikel (pada antigen O). Titer antibodi dilaporkan sesuai dengan pengenceran tertinggi yang masih menunjukkan aglutinasi.

7.      Bila dengan pengenceran 200 kali masih terjadi aglutinasi, pemeriksaan dilanjutkan dengan pengenceran serum yang lebih tinggi sampai tidak terjadi aglutinasi.

b.      Cara slide

·         “Rapid slide screening test”(kualitatif)

1.      Letakkan masing-masing 80 ul serum pada “test slide” nomor 1 smpai nomor 8

2.      Tambahkan masing-masing 1 tetes suspensi antigen yang sebelumnaya telah dikocok terlebih dahulu disamping tetesn serum, kemudian diaduk dengan memakai batang pengaduk (tusuk gigi/lidi) selama beberapa detik.

3.      Goyangkan “slide” selama 1 menit.

4.      Perhatikan adanya reaksi aglutinasi dalam 1 menit.

5.      Reaksi positif bila terjadi aglutinasi dalam 1 menit.

·          “Rapid slide”(kuantitatif)

1.      Letakkan masing-masing 80 ul, 40 ul, 20 ul, 10 ul dan 5 ul serum pada “slide test”.

2.      Tambahkan masing-masing 1 tetes suspensi antigen (misalnya H antigen dari S. typhi) yang sebelumnya telah dikocok terlebih dahulu disamping tetesan serum, kemudian diaduk dengan memakai batang pengaduk (tusuk gigi/lidi) selama beberapa detik.

3.      Goyangkan “slide” selama 1 menit dan perhatikan adanya reaksi aglutinasi dalam 1 menit.

4.      Lakukan pemeriksaan seperti di atas dengan menggunakan yang lain.

5.      Serum 80 ul, 40 ul, 20 ul, 10 ul, dan 5 ul setelah penambahan 1 tetes antigen sesuai dengan pengenceran sebanyak 20, 40, 80, 10 dan 320 kali.

6.      Titer antibodi dilaporkan sesuai dengan pengenceran tertinggi yang masih menunjukkan aglutinasi.

Catatan.

-          Demam tifoid dan paratifoid merupakan infeksi akut, sehingga pemeriksaan widal hanya mempunyai arti diagnostik bila terjadi kenaikan titer antibodi pada fase konvalesen 4 kali lipat atau lebih dibandingkan dengan titer antibodi pada fase akut.

 
               Salmonella tersebar secara luas disekeliling kita, sehingga pada orang sehat dapat dijumpai sejumlah antibodi terhadap Salmonella, karena itu setiap laboratorium harus menetapkan nilai rujukan dari pemeriksaan widal yang perlu diperbaharui setelah beberapa tahun

PEMERIKSAAN VDRL

I.                    Tujuan Pemeriksaan

Untuk mendeteksi adanya antibody non-treponema (Reagin)

II.                  Prinsip pemeriksaan

Pada penderita sifilis akan terbentuk antibody yang terjadi sebagai reaksi terhadap bahan-bahan yang dilepaskan karena kerusakan sel-sel antibody tersebut disebut regain

Regain dalam serum penderita akan berflokulasi bila ditambahkan kardiolipin yaitu antigen yang berasal dari ekstraksi hati sapi.

III.                Alat dan Bahan Pemeriksaan

Alat:

-          Objek glass

-          Mikropipet 10 µl, 20 µl, 40 µl

-          Pipet ukur 10 ml

-          Mikroskop

-          Penangas air

Bahan:

-          Serum darah dan cairan otak

-          Antigen VDRL

-          Larutan garam buffer

-          Larutan garam fisiologis (0,9%)

IV.                Metode

-          Slide

V.                  Prosedur pemeriksaan VDRL pada serum

Persiapan sampel

-          Serum yang jernih dipanaskan dulu dalam penangas air pada suhu 56 °C selama 30 menit, jangan memakai serum yang keruh atau hemolisis.

-          Pemanasan serum perlu diulang pada 56 °C selama 10 menit bila pemeriksaan dilakukan lebih dari 4 jam setelah pemanasan yang pertama.

-          Pemeriksaan dilakukan bila suhu serum sudah sama dengan suhu kamar (23-29 °C).

Reagen

-          Antigen harus tidak berwarna merupakan larutan dalam alcohol yang mengandung 0,03% kardiolipin, 0,9% kolesterol dan leucithin murni (0,21%). Antigen harus disimpan dalam ruangan gelap pada suhu 6-8 °C. bilamana terjadi presipitat, maka larutan antigen tersebut tidak dapat dipergunakan lagi dan harus dibuang. Suspense antigen baru harus dibandingkan terlebih dahulu terhadap larutan antigen yang reaktivitasnya sudah diketahui sebelum dipergunakan dalam pemeriksaan rutin.

-          Larutan garam buffer VDRL dengan pH 6,0+0,1 terdapat komersial atau dapat dibuat dengan komposisi sebagai berikut:

Formaldehyde netral :  0,5 ml

Na2HPO4                        :  0,037 gr

KH2PH2PO4                   :  0,170 gr

NaCl                                  :  10.0 gr

Aquadest ad                  :  1000 ml

-          Larutan garam fisiologis (0,9 % NaCl)

Persiapan Suspensi Antigen

-          Terlebih dahulu simpan botol antigen dan larutan garam buffer VDRL pada suhu kamar selama 15 menit.

-          Pipet 400 µl larutan garam buffer, masukkan kedalam botol reagen ukuran 30 ml. kemudian ditambahkan 500 µl antigen tetes demi tetes langsung diatas larutan garam buffer sambil menggerakkan botol tersebut dengan gerakan memutar pada bidang yang rata.

-         Lanjutkan gerakan memutar botol selama 10 detik.

-         Tambahkan 4100 µl larutan garam buffer. Kocok 30 kali dalam 10 detik.

-         Suspense antigen siap untuk dipakai dan hanya tahan selama 1 hari.

Prosedur pemeriksaan kualitatif

-         Simpan semua alat pemeriksaan, serum dan suspense antigen pada suhu kamar (23°C – 29°C).pemeriksaan yang dilakukan di bawah suhu kamar memberikan reaktivitas yang lebih rendah, sebaliknya bila di atas suhu kamar reaktivitasnya meningkat.

-         Pipet 50 µl serum yang sudah dipanaskan ke atas permukaan slide

-         Pipet 50 µl suspense antigen dan teteskan diatas setiap tetes serum dengan posisi vertical.

-         Slide disimpan di atas rotator dan rotator dihidupkan selama 4 menit. Bila pemeriksaan dilakukan pada udara yang kering dan panas. Sebaiknya slide disimpan di dalam kotak yang berisi tissue/kapas basah untuk menghindari adanya penguapan yang berlebihan.

-         Pembacaan dilakukan segera setelah rotator berhenti dengan menggunakan mikroskop pembessaran 100x.

Pembacaan Hasil

Laporan hasil cukup dengan menyebutkan non-reaktif, reaktif lemah atau reaktif

REAKTIF                :  Bila tampak gumpalan sedang atau besar

REAKTIF LEMAH    :   Bila tampak gumpalan kecil-kecil

NON REAKTIF     :  Bila tidak tampak flokulasi/gumpalan.

Prosedur pemeriksaan kuantitatif

-         Letakkan serum sampel pada baris terdepan rak dan baris kedua berisi tabung dengan 700 µl larutan garam fisiologis

-         Buat pengenceran 1:8 dengan menambahkan 100 mikro serum ke dalam 0,7 ml larutan garam fisiologis.

-         Campur hingga homogen.

-         Letakkan 40 mikro. 20 mikro dan 10 mikro serum yang sudah diencerkan pada lingkaran ke 4. 5 dan 6 dari slide keramik.

-         Buang sisa serum yang sudah diencerkan tadi kedalam tabung pengenceran.

-         Dengan menggunakan pipet yang sama, letakkan 40 mikro, 20 mikro dan 10 mikro serum yang tidak diencerkan pada lingkaran pertama, kedua dan ketiga.

-         Tambahkan 20 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 2  dan 5.

-         Tambahkan 30 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 3 dan 6

-         Slide digoyang perlahan-lahan dengan menggunakan kedua belah tangan selama kurang lebih 15 detik untuk memperoleh campuran yang homogen.

-         Tambahkan 10 mikro suspense antigen pada tiap lingkaran.

-         Tahap selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL kualitatif.

-         Hasil dilaporkan dengan menyebutkan pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan hasil reaktif.

CONTOH:

Pengenceran serum	Laporan hasil	hasil
1:1	Reaktif (+)	Reaktif pada pengenceran
1:2	Reaktif	1:8
1:4	Reaktif	Atau
1:8	Reaktif	Reaktif pada pengenceran
1:16	Non reaktif	8 kali
1:32	Non reaktif

VI.             PEMERIKSAAN VDRL PADA CAIRAN OTAK

Persiapan sampel

Cairan otak disentrfifus dengan kecepatan 300-500 g selama 10 menit kemudian dituangkan kedalam tabung yang bersih. Cairan tersebut siap untuk diperiksa dan tidak perlu pemanasan terlebih dahulu. Cairan otak yang jelas terkontaminasi atau banyak mengandung eritrosit memberikan hasil yang tidak memuaskan.

Persiapan Reagen

-         Antigen, larutan buffer VDRL dan larutan garam fisiologis seperti yag disebutkan pada pemeriksaan VDRL serum.

-         Larutan NaCl 10%

Persiapan suspense antigen

-         Buat suspense antigen VDRL seperti yang dilakukan pada pemeriksaan serum

-         Tambahkan 1 bagian dari 10% larutan NaCl pada 1 bagian suspense antigen VDRL.

-         Campur hingga homogen dengan gerakan memutar dan diamkan selama 5 menit. Suspense ini harus segar dan tidak boleh dipakai lebih dari 2 jam sejak penambahan larutan NaCl.

Prosedur Pemeriksaan Kualitatif

-         Pipet 50 mikron cairan otak ke dalam bagian cekung dari slide

-         Tambahkan 10 mikro suspense antigenpada tiap sampel cairan otak dengan menggunakan pipet mikro.

-         Slide disimpan di atas rotator dan putar selama 8 menit.

-         Pembacaan dan pelaporan hasil seperti pada pemeriksaan serum kualitatif.

Prosedur pemeriksaan kuantitatif

-         Pemeriksaan VDRL kuantitatif pada cairan otak dilakukan bila pada pemeriksaan VDRL kualitatif menunjukkan hasil reaktif

-         Lakukan pengenceran cairan otak sebagai berikut:

-pipet 200 mikro larutan garam fisiologis (0,9%) ke dalam 5 buah tabung atau lebih

-tambahkan 200 mikro cairan otak ke dalam tabung yang pertama. Campur hingga homogeny dan pindahkan 200 mikro ke dalam tabung nomor 2.

-campur hingga homogeny. Kemudian pindahkan 200 mikro cairan dari tabung nomor 2 ke dalam tabung no 3 dan seterusnya, pada tabung terakhir campuran dibuang sebanyak 200 mikro. Sehingga diperoleh pengenceran 1:2. 1:4. 1:8. 1:16 dan seterusnya.

         -     tabung selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL cairan otak kualitatif tahap 1 sampai dengan 3

         -     Pembacaan dan pelaporan hasil dilakukan seperti pemeriksaan serum kuantitatif.

I.                    Tujuan Pemeriksaan

Untuk mendeteksi adanya antibody non-treponema (Reagin)

II.                  Prinsip pemeriksaan

Pada penderita sifilis akan terbentuk antibody yang terjadi sebagai reaksi terhadap bahan-bahan yang dilepaskan karena kerusakan sel-sel antibody tersebut disebut regain

Regain dalam serum penderita akan berflokulasi bila ditambahkan kardiolipin yaitu antigen yang berasal dari ekstraksi hati sapi.

III.                Alat dan Bahan Pemeriksaan

Alat:

-          Objek glass

-          Mikropipet 10 µl, 20 µl, 40 µl

-          Pipet ukur 10 ml

-          Mikroskop

-          Penangas air

Bahan:

-          Serum darah dan cairan otak

-          Antigen VDRL

-          Larutan garam buffer

-          Larutan garam fisiologis (0,9%)

IV.                Metode

-          Slide

V.                  Prosedur pemeriksaan VDRL pada serum

Persiapan sampel

-          Serum yang jernih dipanaskan dulu dalam penangas air pada suhu 56 °C selama 30 menit, jangan memakai serum yang keruh atau hemolisis.

-          Pemanasan serum perlu diulang pada 56 °C selama 10 menit bila pemeriksaan dilakukan lebih dari 4 jam setelah pemanasan yang pertama.

-          Pemeriksaan dilakukan bila suhu serum sudah sama dengan suhu kamar (23-29 °C).

Reagen

-          Antigen harus tidak berwarna merupakan larutan dalam alcohol yang mengandung 0,03% kardiolipin, 0,9% kolesterol dan leucithin murni (0,21%). Antigen harus disimpan dalam ruangan gelap pada suhu 6-8 °C. bilamana terjadi presipitat, maka larutan antigen tersebut tidak dapat dipergunakan lagi dan harus dibuang. Suspense antigen baru harus dibandingkan terlebih dahulu terhadap larutan antigen yang reaktivitasnya sudah diketahui sebelum dipergunakan dalam pemeriksaan rutin.

-          Larutan garam buffer VDRL dengan pH 6,0+0,1 terdapat komersial atau dapat dibuat dengan komposisi sebagai berikut:

Formaldehyde netral :  0,5 ml

Na2HPO4                        :  0,037 gr

KH2PH2PO4                   :  0,170 gr

NaCl                                  :  10.0 gr

Aquadest ad                  :  1000 ml

-          Larutan garam fisiologis (0,9 % NaCl)

Persiapan Suspensi Antigen

-          Terlebih dahulu simpan botol antigen dan larutan garam buffer VDRL pada suhu kamar selama 15 menit.

-          Pipet 400 µl larutan garam buffer, masukkan kedalam botol reagen ukuran 30 ml. kemudian ditambahkan 500 µl antigen tetes demi tetes langsung diatas larutan garam buffer sambil menggerakkan botol tersebut dengan gerakan memutar pada bidang yang rata.

-         Lanjutkan gerakan memutar botol selama 10 detik.

-         Tambahkan 4100 µl larutan garam buffer. Kocok 30 kali dalam 10 detik.

-         Suspense antigen siap untuk dipakai dan hanya tahan selama 1 hari.

Prosedur pemeriksaan kualitatif

-         Simpan semua alat pemeriksaan, serum dan suspense antigen pada suhu kamar (23°C – 29°C).pemeriksaan yang dilakukan di bawah suhu kamar memberikan reaktivitas yang lebih rendah, sebaliknya bila di atas suhu kamar reaktivitasnya meningkat.

-         Pipet 50 µl serum yang sudah dipanaskan ke atas permukaan slide

-         Pipet 50 µl suspense antigen dan teteskan diatas setiap tetes serum dengan posisi vertical.

-         Slide disimpan di atas rotator dan rotator dihidupkan selama 4 menit. Bila pemeriksaan dilakukan pada udara yang kering dan panas. Sebaiknya slide disimpan di dalam kotak yang berisi tissue/kapas basah untuk menghindari adanya penguapan yang berlebihan.

-         Pembacaan dilakukan segera setelah rotator berhenti dengan menggunakan mikroskop pembessaran 100x.

Pembacaan Hasil

Laporan hasil cukup dengan menyebutkan non-reaktif, reaktif lemah atau reaktif

REAKTIF                :  Bila tampak gumpalan sedang atau besar

REAKTIF LEMAH    :   Bila tampak gumpalan kecil-kecil

NON REAKTIF     :  Bila tidak tampak flokulasi/gumpalan.

Prosedur pemeriksaan kuantitatif

-         Letakkan serum sampel pada baris terdepan rak dan baris kedua berisi tabung dengan 700 µl larutan garam fisiologis

-         Buat pengenceran 1:8 dengan menambahkan 100 mikro serum ke dalam 0,7 ml larutan garam fisiologis.

-         Campur hingga homogen.

-         Letakkan 40 mikro. 20 mikro dan 10 mikro serum yang sudah diencerkan pada lingkaran ke 4. 5 dan 6 dari slide keramik.

-         Buang sisa serum yang sudah diencerkan tadi kedalam tabung pengenceran.

-         Dengan menggunakan pipet yang sama, letakkan 40 mikro, 20 mikro dan 10 mikro serum yang tidak diencerkan pada lingkaran pertama, kedua dan ketiga.

-         Tambahkan 20 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 2  dan 5.

-         Tambahkan 30 mikro larutan garam fisiologis pada lingkaran ke 3 dan 6

-         Slide digoyang perlahan-lahan dengan menggunakan kedua belah tangan selama kurang lebih 15 detik untuk memperoleh campuran yang homogen.

-         Tambahkan 10 mikro suspense antigen pada tiap lingkaran.

-         Tahap selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL kualitatif.

-         Hasil dilaporkan dengan menyebutkan pengenceran serum tertinggi yang masih memberikan hasil reaktif.

CONTOH:

Pengenceran serum	Laporan hasil	hasil
1:1	Reaktif (+)	Reaktif pada pengenceran
1:2	Reaktif	1:8
1:4	Reaktif	Atau
1:8	Reaktif	Reaktif pada pengenceran
1:16	Non reaktif	8 kali
1:32	Non reaktif

VI.             PEMERIKSAAN VDRL PADA CAIRAN OTAK

Persiapan sampel

Cairan otak disentrfifus dengan kecepatan 300-500 g selama 10 menit kemudian dituangkan kedalam tabung yang bersih. Cairan tersebut siap untuk diperiksa dan tidak perlu pemanasan terlebih dahulu. Cairan otak yang jelas terkontaminasi atau banyak mengandung eritrosit memberikan hasil yang tidak memuaskan.

Persiapan Reagen

-         Antigen, larutan buffer VDRL dan larutan garam fisiologis seperti yag disebutkan pada pemeriksaan VDRL serum.

-         Larutan NaCl 10%

Persiapan suspense antigen

-         Buat suspense antigen VDRL seperti yang dilakukan pada pemeriksaan serum

-         Tambahkan 1 bagian dari 10% larutan NaCl pada 1 bagian suspense antigen VDRL.

-         Campur hingga homogen dengan gerakan memutar dan diamkan selama 5 menit. Suspense ini harus segar dan tidak boleh dipakai lebih dari 2 jam sejak penambahan larutan NaCl.

Prosedur Pemeriksaan Kualitatif

-         Pipet 50 mikron cairan otak ke dalam bagian cekung dari slide

-         Tambahkan 10 mikro suspense antigenpada tiap sampel cairan otak dengan menggunakan pipet mikro.

-         Slide disimpan di atas rotator dan putar selama 8 menit.

-         Pembacaan dan pelaporan hasil seperti pada pemeriksaan serum kualitatif.

Prosedur pemeriksaan kuantitatif

-         Pemeriksaan VDRL kuantitatif pada cairan otak dilakukan bila pada pemeriksaan VDRL kualitatif menunjukkan hasil reaktif

-         Lakukan pengenceran cairan otak sebagai berikut:

-pipet 200 mikro larutan garam fisiologis (0,9%) ke dalam 5 buah tabung atau lebih

-tambahkan 200 mikro cairan otak ke dalam tabung yang pertama. Campur hingga homogeny dan pindahkan 200 mikro ke dalam tabung nomor 2.

-campur hingga homogeny. Kemudian pindahkan 200 mikro cairan dari tabung nomor 2 ke dalam tabung no 3 dan seterusnya, pada tabung terakhir campuran dibuang sebanyak 200 mikro. Sehingga diperoleh pengenceran 1:2. 1:4. 1:8. 1:16 dan seterusnya.

         -     tabung selanjutnya dilakukan seperti pemeriksaan VDRL cairan otak kualitatif tahap 1 sampai dengan 3

         -     Pembacaan dan pelaporan hasil dilakukan seperti pemeriksaan serum kuantitatif.